华理开发新型荧光染料Peppers 助力细胞RNA实时成像

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2019年9月23日,华东理工大学朱麟勇及杨弋一起通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为”Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs“的研究论文,该研究开发了Peppers,一系列单体,明亮且稳定的具有荧光RNA,其最大发射范围从青色到红色。Peppers还需用对活细胞中的各种RNA进行简单而强大的成像,而对目标RNA的转录,定位和翻译的干扰影响非常小。

定量分析单个细胞中蛋白质及其信使RNA的水平表明,翻译受正常的酶动力学控制,但具有明显的异质性。该研究进一步证明,Peppers可用于通过CRISPR展示对基因组基因座进行成像,实时跟踪蛋白质-RNA链以及进行超分辨率成像。总而言之,什么FR将是细胞RNA实时成像的有用工具。

RNA在细胞中表现出错综复杂的动力学,包括表达,降解,易位,剪接和其他化学修饰。但会 ,非常需用相似于荧光蛋白标签来理解RNA的动态分子生物学。感兴趣的RNA还需用通过荧光原位杂交标记,或通过标记被特定酶识别的型态基序共价标记。不幸的是,这种 技术需用细胞固定但会 不适用于活细胞成像。具有工程化基序的RNA还需用与荧光蛋白和特定RNA结合蛋白的融合物拴在一起。相似,MCP,PCP,λN或Cas。

Pepper5400 RMFP的型态

在什么法子 中,机会未结合的荧光蛋白融合物自由扩散,但会 位于显著的背景荧光,但会 每个RNA最多需用48个绿色荧光蛋白(GFP)融合物不需要 获得最佳信噪比。这种 束缚蛋白的沉重负荷否是会影响RNA的定位,稳定性和行为仍有待选泽。尽管位于什么位于问题,MS2系统还是当前活细胞RNA成像的金标准,被广泛用于研究单分子水平的RNA行为。更直接地,目标RNA还需用与结合荧光团的RNA适体融合并可视化。

扩大FR的光谱范围

尽管机会认识到这种 概念已有好几年了,但会 其他什么荧光团和荧光团-猝灭剂结合物在活细胞中具有显著着的背景荧光和/或不易扩散跨质膜。Jaffrey和他的同事率先开发了GFP的RNA模拟物(RMFP),它们是与GFP荧光团的非荧光相似物特异性结合并激活其荧光的适体。在活细胞中,什么荧光团显示出大大减少的背景荧光,突出了RMFP信号两种。 RMFPs已成功地用于对几种丰厚的细胞RNA种类进行成像,并已被开发为代谢产物和蛋白质的传感器。

使用Pepper的CRISPR展示对基因组基因座进行多色成像

尽管什么RMFP看上去简单而有前途,但它们具有显著的局限性,相似相对较低的亮度,仅绿色的可用性,有限的热稳定性或光稳定性或多聚体性质,这机会会阻碍其广泛用于活的哺乳动物细胞和体内的一般成像应用,尤其是成像mRNA,其丰度比核糖体RNA和转移RNA低哪几个个数量级。具有改善的细胞亮度,稳定性和最大范围的荧光发射最大值(有点痛 是在红色区域)的RMFP仍然是理想的,但尚未实现。

在这里,研究人员开发了Peppers,一系列单体,明亮且稳定的具有荧光RNA,其最大发射范围从青色到红色。Peppers还需用对活细胞中的各种RNA进行简单而强大的成像,而对目标RNA的转录,定位和翻译的干扰影响非常小。定量分析单个细胞中蛋白质及其信使RNA的水平表明,翻译受正常的酶动力学控制,但具有明显的异质性。该研究进一步证明,Peppers可用于通过CRISPR展示对基因组基因座进行成像,实时跟踪蛋白质-RNA链以及进行超分辨率成像。总而言之,什么FR将是细胞RNA实时成像的有用工具。

研究背景

结合并激活荧光染料的适体荧光RNA(FR)已用于对丰厚的细胞RNA种类进行成像。然而,诸如低亮度和具有不同光谱型态的染料/适体组合的有限可用性的局限性,限制了什么工具在活的哺乳动物细胞和体内的使用。

在生物大分子中,RNA具有独特的型态和种类繁多的生物学功能,与人类重大疾病的位于和发展密切相关。近年来RNA生物学研究进展很慢了 了 ,不同种类的RNA及其修饰形式的鉴定、起源、功能与调控机会成为了国际研究前沿,而siRNA, RNA适配体及最新老会 跳出的CRISPR/Cas9等基于RNA的基因操作、分子识别技术也是国际生物技术应用的重要热点。什么研究不仅革新了我门 对其他生物学基本概念和基本问题图片的认知,但会 在生命科学、生物工程和医学中具有广阔的应用前景。

细胞内的RNA像DNA一样由两种碱基来编码,其序列容易测定,但会 近年测序技术的发展极大推动了RNA研究的进展。个人面,RNA又像蛋白质一样具有错综复杂的四级型态与相互作用,具有特定的时间、空间分布及不同的转录后修饰情况。何如对活细胞RNA特异标记与成像,实时监测RNA在活细胞中各种行为,如生成、运输、定位、降解等,这是深入研究RNA功能机制极为有用的工具和需用处置的重要技术挑战。

实在荧光原位杂交技术,或是酶反应催化的RNA化学共价标记技术(图1A)均可用来标记RNA,但什么技术目前可不都可以 了用于固定化细胞亦即死细胞的研究,不适合对活细胞内RNA进行分析。利用分子信标技术还需用对活细胞RNA进行标记成像(图1B),但其位于着荧光背景高、细胞核内非特异性聚集、易受RNA二级型态的影响、需用对每条RNA专门定制合成寡核苷酸探针等困难,至今还难以全部处置。RNA系链 (tethering) 标记系统则是通过MS2, PP7, λN, CRISPR/Cas9等RNA结合蛋白与特定RNA序列的相互作用,将多个荧光蛋白系链到靶标RNA分子上,通过跟踪荧光蛋白的信号示踪靶标RNA(图1C)。但没与靶标RNA结合的融合蛋白会扩散到整个细胞中,进而产生很强的背景荧光,干扰真实的RNA含量与分布信息;为了获取足够信号,通常需用在RNA的上融合数六个拷贝的RNA结合蛋白的结合序列,机会会影响其融合的靶标RNA的功能。目前,分子信标技术和RNA系链标记技术还是主要用于活细胞内具有重复序列的RNA单分子分析。

荧光蛋白可帮助研究人员“照亮”蛋白质在活细胞与活体中的各种行为,这极大地利于了蛋白质科学的研究。荧光蛋白标签的美妙之位于于它还需用与目的蛋白融合,实现简单直接的荧光标记。在短短十余年内,荧光蛋白技术研究即被授予诺贝尔奖。同理,RNA研究也迫切需用两种与荧光蛋白相似,简单、直接与普适性的活细胞与活体标记法子 。自然界尚未发现纯天然位于的荧光RNA。4003年诺奖得主钱永健首次提出利用核酸适配体特异性结合染料并激活其荧光的法子 (图1D),这种 ”荧光RNA”还需用与目标RNA融合,有望在活细胞内实现任意RNA分子特异性的直接标记。十余年来,科学家们老会 试图针对核酸染料如孔雀绿、Hoechst、硫黄素,或是荧光团-淬灭基团染料等发展人工合成的荧光RNA。但机会什么染料荧光本底高、透膜性弱等问题图片,仅有少数种类被报道可用于动物细胞内少数高丰度、聚集态或具有极少量重复序列RNA的成像。基于荧光蛋白生色团的“拟荧光蛋白RNA”则克服了背景与染料透膜的问题图片,但什么荧光RNA亮度、稳定性又很低,在动物细胞内同样可不都可以 了用于高丰度或聚集态RNA的成像。迄今为止,RNA研究领域还没办法 老会 跳出相似于荧光蛋白从前简单有效,普遍适用的活细胞荧光标记工具。

理想的荧光RNA应该是单体、深度图稳定、高亮度、低背景、多种颜色。可不都可以 了在各方面的性能均取得突破性进展后,荧光RNA才会从概念走向实用。

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